Год издания: 2019
Ключевые слова: биолюминесценция, грибы, биотехнология, тест-системы, люцифераза, светящиеся грибы, Neonothopanus nambi, люциферин, люминесцентная система
Аннотация: Биолюминесцентные методы исследования очень разнообразны и применяются in vitro и in vivo для анализа метаболитов, в иммунологических исследованиях, изучения экспрессии генов и экологическом мониторинге. Биолюминесценция нашла широкое применение в медицине для изучения таких болезней, как диабет, онкологические, инфекционные и нейрПоказать полностьюодегенеративные заболевания (Magalhães C.M., Esteves da Silva J.C., Pinto da Silva L. (2016) Chemiluminescence and Bioluminescence as an Excitation Source in the Photodynamic Therapy of Cancer: A Critical Review Chemphyschem. 7(15):2286-94), а также для скрининга лекарственных препаратов (Kelkar M., De A. (2012) Bioluminescence based in vivo screening technologies. Curr Opin Pharmacol. 12(5):592-600), для биоимиджинга живых систем в режиме реального времени (полученные биолюминесцентные трансгенные животные в дальнейшем применяются в доклинических исследованиях (Coleman S., and McGregor A. (2015) A bright future for bioluminescent imaging in viral research. Future Virol. ; 10(2): 169–183)), также биоимиджинг широко используется для исследования белок-белковых взаимодействий. Поскольку различные классы люцифераз принципиально отличаются друг от друга по структуре белка и субстратной специфичности, их большее разнообразие позволит увеличить и методический спектр применения в фундаментальных и прикладных целях .?Найденная нашей лабораторией в рамках проекта РНФ люцифераза гриба Neonothapanus nambi принадлежит к принципиально новому семейству белков, не имеющих гомологии с какими-либо описанными ранее белками. Нами была показана биолюминесцентная активность этой люциферазы при гетерологической экспрессии гена в клетках Pichia pastoris и млекопитающих. В рамках настоящего проекта мы планируем несколько задач, имеющих как фундаментальное значение, так и практическое применение. Нами будут получены линии клеток млекопитающих, стабильно экспрессирующие люциферазу гриба Neonothapanus nambi. Такие линии клеток успешно применяются в доклинических исследованиях противоопухолевой терапии (De A., Loening A.M., S.S. (2007) An Improved Bioluminescence Resonance Energy Transfer Strategy for Imaging Intracellular Events in Single Cells and Living Subjects. Cancer Res. Aug 1; 67(15): 7175–7183).?Так как люцифераза грибов является мембранным белком, в процессе работы будут изучены различные среды, имитирующие мембранное окружение, в которых белок имеет нативные структуру и активность, но при этом которые отлично подходят для структурных и биофизических методов исследования. Для увеличения яркости люциферазы при таких исследованиях будет проведен мутагенез гена люциферазы, включающий модификацию N-концевого участка. Для оценки люминесцентной активности полученных мутантов, а также для детекции люциферазы в денатурированном и неактивном состоянии нами предполагается получить антитела к этому белку, что в значительной мере расширит области применения этой люциферазы и возможности постановки различных контролей. Кроме того, планируется провести масштабный подбор условий для кристаллизации люциферазы. Кристаллизация мембранных белков сопряжена со значительными трудностями (Parker J.L., Newstead S. (2016) Membrane Protein Crystallisation: Current Trends and Future Perspectives. Adv Exp Med Biol.; 922: 61–72), поскольку необходима их солюбилизация при одновременном сохранении нативной структуры и стабильности. На данный момент разрешена структура чуть более 600 мембранных белков, из более, чем 50000 известных белков, ассоциированных с мембранами. Информация, полученная при кристаллизации каждого нового мембранного белка, позволяет улучшить точность алгоритмов предсказания подобных структур и аналогичных белковых доменов.