Год издания: 2022
Ключевые слова: целентеразин, люцифераза, фотопротеин, структура и функция белков
Аннотация: Биолюминесценция – широко распространенное природное явление. Светящиеся организмы встречаются среди бактерий, грибов, простейших, кишечнополостных, червей, моллюсков, насекомых и рыб. Хотя эти организмы стоят на разных ступенях эволюции, природа свечения одинакова. Фактически, биолюминесценция – это хемилюминесцентная реакция, в кПоказать полностьюоторой происходит окисление субстрата – люциферина, катализируемое специфическим ферментом – люциферазой. Люциферины и люциферазы разных организмов – соединения различной структуры и поэтому это, скорее, собирательное и функциональное понятие, чем структурно-химическое. ??Неослабевающее внимание исследователей к изучению биолюминесценции отчасти объясняется желанием понять молекулярный механизм функционирования конкретных биолюминесцентных белков из различных организмов, и установить общие закономерности, лежащие в основе конверсии энергии химических связей субстрата в свет видимого диапазона, происходящей при участии белков. Но все-таки основной движущей силой, определяющей интерес к изучению биолюминесценции, является возможность создания высокочувствительных аналитических систем на основе биолюминесцентных белков для применения в медицинской диагностике и визуализации внутриклеточных процессов in vivo на уровне клетки и целого организма. ??Среди нескольких люциферинов, идентифицированных в морских организмах, наиболее широко распространен целентеразин. Целентеразин идентифицирован как субстрат биолюминесцентной реакции в радиоляриях, ктенофорах, кишечнополостных, копеподах, некоторых рыбах, а также, вполне вероятно, он является субстратом и во многих других, еще неисследованных светящихся организмах. Однако, несмотря на использование одного и того же субстрата и идентичный химический механизм его окисления, белки, катализирующие целентеразин-зависимые биолюминесцентные реакции, отличаются поразительным разнообразием. В настоящее время среди этих биолюминесцентных белков изучена лишь малая часть, что не позволяет сделать обобщающих заключений о сходстве и разнообразии их структурно-функциональной организации. Несмотря на имеющиеся недостатки, целентеразин-зависимые биолюминесцентные белки широко применяются в качестве репортерных молекул в исследованиях в области экспериментальной медицины и клеточной биологии. ??В рамках данного проекта планируется сконструировать целентеразин-зависимые биолюминесцентные белки с улучшенными репортерными свойствами, такими как, например, смещенный в область более высоких температур оптимум биолюминесцентной реакции, повышенная термостабильность, смещенный в длинноволновую область спектр излучения, увеличенная специфическая биолюминесцентная активность. Для достижения этих целей планируется использовать методы сайт-направленного и случайного мутагенеза, а также методы компьютерного моделирования. Такой подход очень перспективен, поскольку в последнее время достигнут существенный прогресс в области предсказания и анализа пространственных структур белков с использованием методов глубокого машинного обучения, включая подход AlphaFold, и применения предобученных лингвистических моделей. Применение методов машинного обучения в комбинации с методами молекулярного моделирования позволит выявить аминокислотные остатки, физико-химические и конформационные характеристики целентеразин-зависимых биолюминесцентных белков, модулирующие их биолюминесцентные свойства, и построить компьютерные модели для предсказания аминокислотных замен, целенаправленно меняющих эти свойства. Сочетание теоретических и экспериментальных методов позволит не только сконструировать биолюминесцентные белки с улучшенными репортерными свойствами для аналитических применений in vivo и in vitro (или даже de novo сконструировать «искусственные» целентеразин-зависимые люциферазы и фотопротеины), но и позволит получить новые знания о структурно-функциональной организации целентеразин-зависимых биолюминесцентных белков, включая функциональную роль аминокислотных остатков в каталитическом окислении целентеразина и формировании эмиттера у разного типа этих белков.