Тип публикации: доклад, тезисы доклада, статья из сборника материалов конференций
Конференция: XIII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии; Владивосток; Владивосток
Год издания: 2010
Ключевые слова: yersinia pseudotuberculosis, OMPF порин, антибактериальный иммунитет, структурно-функциональная организация, иммунобиологические свойства, антигенные свойства, белки, сайт-направленный мутагенез, мутантные конструкции, ompF ген, система "QuikChange site-directed mutagenesis", TurboTaq полимераза, мутантные праймеры
Аннотация: Ранее в Лаборатории морской биохимии ТИБОХ ДВО РАН был клонирован и экспрессирован OmpF порин возбудителя псевдотуберкулёза Yersinia pseudotuberculosis, а в Лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН были исследованы его структурно-функциональная организация и иммунобиологические свойства. Изменяя стПоказать полностьюруктуру белка с помощью сайт-направленного мутагенеза и наблюдая за изменением его свойств, можно делать выводы о функциональной значимости тех или иных участков белковой молекулы. Что касается поринов, наиболее интересными представляются исследования участков внешних петель, которые, по литературным данным, ответственны за стабилизацию структуры и антигенные свойства этих белков, а также участвуют в модуляции проводимости пориновых каналов. Для получения мутантных конструкций, несущих ompF ген с делециями петель, была использована система "QuikChange site-directed mutagenesis" (Stratagene, США) с применением TurboTaq полимеразы и мутантных праймеров. С целью оптимизации процесса получения мутантных рекомбинантных OmpF поринов были опробованы 2 различных подхода. Суть первого метода получения рекомбинантного мутантного белка состояла в следующем: 1. Трансформация полученной мутантной плазмидной ДНК в компетентные клетки Тор10; 2. Поиск колоний, содержащих мутантные плазмиды, с помощью ПЦР; 3. Выделение плазмидной ДНК из отобранных колоний; 4. Трансформация мутантной плазмидной ДНК в экспрессионный штамм BL21(DE3); 5. Экспрессия мутантного белка. 6. Секвенирование "функциональных" плазмид. Суть альтернативного метода получения рекомбинантного белка состояла в уменьшении количества этапов и заключалась в следующем: 1. Трансформация полученной после мутагенеза плазмидной ДНК в экспрессионный штамм Rosetta; 2. Экспрессия белка с целью отбора колоний, экспрессирующих мутантный целевой порин; 3. Проведение ПЦР отобранных "рабочих" колоний с праймерами Т7; 4. Секвенирование ПЦР-продукта. Показано, что функциональные колонии, экспрессирующие мутантные белки, имеются в экспрессионных конструкциях, полученных обоими методами. Это позволяет считать оба способа эффективными и результативными, но второй метод существенно экономит время и уменьшает количество экспериментов, необходимых для получения целевых мутантных белков. Работа поддержана грантом ДВО РАН "Конструирование и структурно-функциональное исследование мутантных OmpF поринов наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis" no разделу "Фундаментальные исследования молодых ученых".
Журнал: XIII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии
Номера страниц: 62-62
Издатель: Издательство